在研究多肽活体自组装的过程中, 非天然氨基酸的引入能够发展更多特殊生物功能的纳米生物材料. 在实际研究中, 含有非天然氨基酸的多肽分子在活体内原位自组装进行离子检测方面表现出了高特异性. 虽然以往的研究对于Hg2+的毒性已经有了一定的认识, 但是对于Hg2+在生物体内的分布和循环过程仍需要进一步研究,目前还缺乏能在活体情况下对Hg2+分布进行有效检测的荧光探针[23]. 针对此难题, Zhao课题组[24]利用配位作用诱导多肽自组装同时伴随着聚集诱导发光效应(aggregation induced emission, AIE), 其对Hg2+的检测具有很好的应用前景和借鉴意义. 他们将一条含有γ-谷氨酸的谷胱甘肽与具有AIE效应的四苯基乙烯(tetraphenylethylene, PTE)进行偶联, 利用谷胱甘肽中半胱氨酸上的巯基和γ-谷氨酸上羧基与Hg2+的配位得到的络合物分子, 该分子可以通过π-π相互作用堆叠形成超分子组装体, 随着分子在原位富集形成纳米纤维或扭曲形成更大的纤维(图2(a)). 利用PTE具有的AIE效应, 由荧光的强度变化实现对HeLa细胞和斑马鱼中Hg2+分布的检测(图2(b, c)). 需要指出的是, 由于人体细胞微环境内各种离子含量的复杂性, 如何提高该方法对目标离子的特异性是此类课题进行深入开展所需要解决的问题.
3 体内多肽自组装体在组织工程方面的应用
体内多肽自组装体还可以应用于组织修复的研究. 利用体内多肽自组装策略可以实现对常见疾病——心肌梗塞或椎间盘磨损的微创乃至无创修复[25]. 传统上, 针对心力衰竭引起的心肌梗塞导致的左心房感染所引发的左心室壁变薄情况, 没有很有效的直接导入修复性修复治疗材料的方法. 虽然有文献报道[26]将生物材料通过导管或者针头向心肌内直接注射的研究, 但是这种方法对心肌的侵入性大, 且操作风险高, 不是一种具有临床转化前景的研究手段. Christman课题组[25]则另辟蹊径, 利用正常心脏部位脉管所具有的高渗透和滞留效应(enhanced permeability and retention effect, EPR), 设计了一段含有对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)具有特异性响应的多肽(PLGLAG)的两亲性分子(图3(a)). 该分子通过透析得到的材料呈纳米囊泡状, 经过血液循环和EPR效应在发生心肌梗塞部位富集时, 能被该部位过表达的MMP-2和MMP-9酶特异性水解, 原位形成纳米纤维的组装结构(图3(b)), 从而将生物修复材料在心肌部位的滞留时间从1 h提高到7 d (图3(c)). 而通过心肌梗塞的老鼠模型实验, 也证明了该策略对心肌损伤修复的高效性(图3(d)).
在组织修复方面, 通过对体内多肽自组装体的设计, 还可以起到药物原位缓释作用. Wilcox课题组[27]利用体内多肽自组装策略, 实现了对由于软骨素(葡萄糖胺聚糖)流失而引起的椎间盘磨损治疗的微创化. 利用多肽分子原位快速响应形成组装体的原理, 可以显著提高软骨素在目标部位的滞留时间, 进而提高软骨素对椎间盘磨损的修复作用. Wilcox课题组所采取的方法是先向病灶部位注射软骨素, 而后再注入具有原位响应形成水凝胶性质的多肽分子. 多肽分子与软骨素在病灶部位原位共组装形成水凝胶, 整个过程仅需要利用针头注射, 实现了对椎间盘磨损的微创治疗.
利用多肽作为药物载体具有多种优势, 因此该方向得到广泛研究[28~31]. 针对药物循环易流失、传统药物载体药物负载释放过程过于复杂且效率低的弊端, 利用体内多肽自组装策略在病灶部位构筑药物原位释放模型具有很好的应用优势. Zhong课题组[32]设计了一段对Zn2+具有响应性的分叉型多肽E3-Fn, 用于治疗前列腺癌症的药物输送平台. 具有Zn2+响应组装性质的多肽E3-F3与亚德里亚霉素混合物溶液呈澄清状, 将溶液注射进Zn2+浓度远高于其他部位的前列腺部位后, 多肽分子与Zn2+配位原位组装形成水凝胶同时将药物分子锁定, 进而起到药物的精准缓释作用.
4 体内多肽自组装体用于神经退行性疾病的治疗
随着我国老龄化的加剧, 神经退行性疾病患病率不断增长. 神经退行性疾病是一类大脑和脊髓神经元细胞丧失的疾病状态, 神经元细胞一般不会再生, 过度的损害可能是毁灭性的, 不可逆转的. 科学家们一直在努力寻找神经退行性疾病的治疗方法. 本课题组[33]利用多肽纳米颗粒作为“纳米清道夫”来治疗阿尔兹海默病的研究则为这种利用外源性多肽与体内多肽进行共组装的研究指明了未来的研究方向. 阿尔兹海默病主要是由淀粉样纤维Aβ为基础的细胞外自组装纤维沉积和含有高磷的胞内神经原纤维的缠结所引起的[34]. 人体大脑在正常生理条件下也会产生Aβ, 但是自身免疫系统会将其进行清除, 当清除的速率低于产生的速率时, 就产生了纤维的堆积[34]. 如何能够实现对形成的沉积蛋白进行清除是治疗该类疾病的一大突破口.
在研究中, 我们合成了一个多功能的纳米颗粒, 带正电的壳聚糖的高分子为内核, 连接GKLVFF多肽片段用于捕捉Aβ蛋白, 并修饰以自噬相关蛋白(Beclin-1)多肽片段, 能够激活自噬(图4(a)). 在该结构中, PEG能显著提高分子在水中的分散性, 也提升该“清道夫”的生物相容性和稳定性. 分子中的KLVFF能通过氢键作用与Aβ-42进行共组装, 而Beclin-1则能够激活自噬分解共组装多肽组装体. 纳米清道夫通过氢键将Aβ捕获, 复合体通过内吞作用进入细胞, 清道夫上的受体Beclin-1激活细胞自噬使得清道夫与Aβ蛋白一同被降解(图4(b)). 体外实验以及小鼠的活体实验均证明了材料对Aβ蛋白高效的清理能力. 利用外源性引入的多肽与Aβ-42间通过氢键作用进行共组装形成纳米颗粒, 清除脑部产生的淀粉样纤维Aβ蛋白则为临床上该疾病的治疗带来了希望.
5 总结与展望
合理设计体内原位自组装体结构以实现特定功能, 在生物医学领域具有极大的潜在应用价值. 我们通过活体自组装策略构筑的多肽自组装体在肿瘤以及非肿瘤相关的重大疾病诊断和治疗方面发挥着重要作用. 当然, 在体内多肽自组装体的研究中, 我们还面临着一系列的困难. 首先, 活体内原位表征多肽组装体的结构一直是一个难点. 虽然我们能通过体外实验很好地模拟多肽及其剪切残基在体外的组装过程, 但是活体内的生理环境远比体外模拟的环境复杂. 从多肽分子离开针头那一刻起的所有多肽分子在体内的物理化学行为都脱离了我们的控制. 因此, 目前亟待解决的一大难点是多肽分子在生物体内的靶向、响应、组装和代谢的动力学行为控制和表征的研究.
此外, 已有的天然多肽与通过蛋白修饰或改性获得的多肽难以满足日益扩大的临床需要, 通过合成生物学及合成化学手段发展更高效的合成、筛选手段以得到具有更好组装性能、更精准特异性靶点和更高稳定性的多肽是这个研究领域发展中必然经历的阶段.
最后, 在发展新的功能性多肽的同时, 对已知多肽结构的修饰改性以提高其生物利用度和改善其在体内组装行为仍不失为一种改善多肽材料性能的有效手段. 在这个过程中, 利用天然氨基酸在多肽或蛋白上进行突变是一种能将对天然多肽影响降到最低的方式. 或者通过引入非天然氨基酸如D型氨基酸或β及γ氨基酸等结构将有可能成为改善多肽自组装纳米材料生物效应的另一突破口. 实现这一目标的前提是计算科学和合成化学的进一步发展.
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