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Http://Www.YaoKuo.Com/ 湖南中医学院学报 2005年10月第25卷第5期 Journal of TCM Univ.of Hunan Ort.2005 Vol. 25 No. 5 三七有效成分对人子宫内膜细胞培养液 NO及NOS的影响 游 慧，付灵梅，谭朝阳，尤昭玲 (湖南中医学院中西医结合系，湖南长沙410007) [摘 要」目的探讨三七不同有效成分干预人子宫内膜炎症模型后，其细胞培养液中一氧化氮(NO)和 一氧化氮合酶(NOS)活力的变化。方法以三七有效成分干预炎症子宫内膜细胞模型，分别测定48 h及72 h NO, NOS的活力。结果模型组细胞培养液中NO, NOS活力较正常对照组明显增高(P 0.01)。经药物干预 后，三七复方组和三七氛酸组NO和NOS活力都明显低于同时段的模型组(P0.01)。而48 h三七皂普组 与同时段模型组比较，NO含量、NOS活力明显升高，差异具有统计学意义(P0.05);72h三七皂普组NO含 量、NOS活力较同时段模型组明显降低(尸0.05,P0.01)。而三七复方组和正常对照组比较差异无统计 学意义(尸 0.05)。结论三七复方、三七氛酸能明显降低炎症性子宫内膜细胞培养液中NO, NOS活力，调 节血管的舒缩功能，从而达到止血的目的。三七皂普在短时间内可升高NO和NOS含量，改善局部血流，消 除已存在的疟血，化瘫后更有助于三七氛酸发挥止血的功效。 〔关键词)三七有效成分;子宫内膜细胞;NO; NOS (中图分类号〕R 285.5(文献标识码〕A(文章编号〕1000-5633(2005)05-0012-02 Effect of Available Composition of Panax Notoginseng on NO，NOS of RPM11640 of Human Endometrial Cell You Hui，Fu Lingimei, Tan Zhaoyang,et al ) (TCM univ. of Hunan, Changsha 410007 (Abstract) Objective To evaluate the effect of active principle of panax notoginseng on change of vi- tality in culture fluid of NO and NOS from human endometrial cell infammatory model. Methods The cell model of inflammatory human endometium was induced场active prineiple of panax notoginseng, which was interposed场the best concentration established in former experiment. And vitaility of NO, NOS has been de- Http://Www.Caiyifa.Com/ terminated in 48 h and 72 h. Result The active prineiple of panax notoginseng can distinctly decrease NO, NOS of the RPM11640 of human endometrial cell to near normality. Conclusion The compound of panax no- toginseng can lower distinc街vitality of NO and NOS in the culture fluid, regulate diastolic function of blood vessel，and get hemostatic result. Sapomn of panax noto ginseng can increase the content of NO and NOS in short time, improve blood flow in local~ and remove blood stasis. (Key words) Compound components of panax notoginseng; Endometrial cell; NO; NOS 炎症因素所致的子宫异常出血是中西医妇产科临床 理研究，目前报道也较少。西医对异常子宫出血治疗是治 常见病症，如急慢性盆腔炎、子宫内膜炎、宫内节育器或药 标难治本，且有一定的副作用，传统中医药对妇产科“血 流人流后出血、产后出血及恶露不绝等均与炎症有直接或 证”治疗效果显著、颇具特色。三七是化痕止血名药，在妇 较密切关系。迄今有关子宫内膜出血、止血修复的研究尚 产科“血证”中尤为常用，但其“化疲止血”的作用途径仍不 不深人，而炎症所致子宫出血及炎症、止血、修复的有关机 清楚。本课题在利用前期的LPS诱导子宫内膜的炎症模 〔收稿日期)2004-10-20 〔墓金项目)国家自然科学基金资助项目(030271633)0 〔作者简介〕游 慧(1977一)，女，湖南长沙人，医学硕士，从事妇产科临床研究工作。 Http://Www.YaoKuo.Com/ 第5期 游 慧，等 三七有效成分对人子宫内膜细胞培养液NO及NOS的影响 型等实验研究的基础上，对炎症细胞模型施加三七有效成 预药物，收集48, 72 h两个时间段的细胞培养液，1 000/min 分，与子宫内膜局部炎症、凝血网络相关的NO, NOS的分 离心10 min，取培养上清液进行NO, NOS的检测。 泌来探讨三七有效成分影响子宫内膜止血与修复的机制。 1.3统计学处理 所有数据采用均数土标准差(x土，)表示，组间两两比 1材料与方法 较采用方差分析及9检验。所有资料均经SPSS11.0统计 1.1材料 软件作数据分析。 1.1.1试剂 LPS (SIGMA公司0127:138),溶于DMEM/F- 2 结果 12(含10%胎牛血清)的培养液中，用0.22 pm滤膜加压过 滤除菌，置4℃过夜备用。干预药物:三七用乙醇渗滚提 实验结果见表1、表2，模型组细胞培养液中NO, NOS 取，醇提液回收乙醇，过大孔树脂柱，分离得总皂昔，剩余 活力较正常对照组明显增高(P0.01)。经药物干预后， 液过离子交换柱，分离三七氨酸。三七皂昔和三七氨酸的 三七复方组和三七氨酸组NO含量及NOS活力与同时段 比例按照生药三七中两者的比例(三七皂昔8%、三七氨 模型组相比明显降低(P0.05,P0.01)。而48 h三七 酸0.4%)配制，由本实验室分离制备。溶于DMEM/F-12 皂昔组与同时段模型组比较，NO含量、NOS活力明显升 (含10%胎牛血清)培养液中，用0.22 pm滤膜加压过滤除 高，差异具有统计学意义(P0.05),72h三七皂昔组NO 菌，置4℃过夜备用。DMEM/F-12培养基(GIBCO产品，加 含量、NOS活力较同时段模型组明显降低(P0.05,P 人青霉素100 U/mL，链霉素100 U /mL，肝素50 mg /mL)，胎 0.01)。而三七复方组和正常对照组比较差异无统计学意 牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶 义(P0.05)。 (上海生工，配制成0.25%浓度后4℃冷藏过夜)。 表1三七复方成分对人子宫内膜细胞培养液NO 1.1.2仪器 COz培养箱(德国贺利氏Heracell) ;超净工 含t的影响 (feral/L,n二3,x士s) 药物剂量 作台(苏州SW-口-2FD);倒置显微镜(重庆光学仪器厂); 组 别 48 h (mg/mL) 酶标仪(芬兰 MK3) ;荧光显微镜(江南光学仪器 三七皂昔组 0.0408 215.88士32.38△口口0172.11土21.030△口口令 2 3 1 9 7 1 0 5 1 3 9 厂)。 .59土10.1600令 550△口O 三七氨酸组 0.002 126 .62 t9. 1.1.3检测药盒 NO试剂盒、NOS试剂盒(南京建成生 三七复方组 0.0428 103.66土7.05△ .88士134200 物工程研究所)。 正常对照组 一 %67士8.的△△ .卯 土11020n 1.2方法 一 176.81土11.08☆口口O .71 t 28.05口 1.2.1标本来源 组织标本均来自于门诊诊刮病人，患 :48 h与72 h时间段相比较☆p 0.01;与模型组同时段 者年龄18-45岁，3个月内未服用任何激素类药物，如避 相比较△P0.05,△△P 0.01;与三七复方组同时段相比较 口P 0.05，口口P 0.01;与正常对照组同时段相比较令P 孕药、氟灭酸等影响内分泌的药物。刮取月经周期7一14 0.01,令今P 0.05。下表同。 d的子宫腔前、后壁正常内膜各2条。全过程均在无菌条 表2 三七复方成分对人子宫内膜细胞培养液NC6 件下完成，标本在30 min内低温转送到实验室进行处理。 活力的影响 (U/mL,n二3,x士:) 选取刮取子宫内膜送病检正常者的组织进行实验。 药物剂量 Http://Www.Caiyifa.Com/ 1.2.2子宫内膜细胞的培养方法 培养方法参照文献 组 别 (mg/ML) 48 h [1]。用0.25%的胰蛋白酶2一3 mL，置37℃恒温水浴箱 三七皂昔组 0.0408 13.05士1.扣☆△口口今 10.46土1.61△口令令 中振荡消化10 min后，加人DMEM/F-12(含10%胎牛血 三七氨酸组 0.侧犯 8.68 t 0.67 8.78士1.080 清)终止消化。反复吹打未消化的组织块，经台盼蓝染色 三七复方组 0.碗H28 7.12土0.1800 8.11士0.54A 证明活细胞数大于90%，并调整细胞密度为1 x 105 /ML, 正常对照组 7.05土0.9300 7.83士0.7200 吸出细胞悬液放入培养瓶，置于37 t,5 %Cq培养箱中 模 型 组 10.40土1.叼口口令 11.41土1.别尸口令 培养。传代后的细胞接种于%孔培养板中，待细胞重新 3讨论 长满汇合后，用于以下实验。 1.2.3样品制备 将接种于%孔培养板中处于对数生 自从1980年Furchgott和Zawadski发现血管内皮细胞 长期的细胞，随机分为5组，设正常对照组、模型组、三七 释放一种舒张平滑肌的物质以来，NO与血管舒张因子的 皂昔组、三七氨酸组、三七复方组，每组3个样本。根据前 关系曾经引起人们长时间的争论。现在已经证明信息分 期】TS、三七有效成分细胞毒试验所确定的浓度给各组施 子NO参与了人体众多的生理、病理过程,NO就是血管舒 加药物。各组换液后添加药物，空白对照组添加等量的 张因子。NO是体内调节血管舒张功能的活力物质，炎症 DMEM/F-12(含10%胎牛血清)。三七皂昔组、三七氨酸 可刺激内皮细胞和巨噬细胞产生大量的NO，可引起子宫 组、三七复方组分别同时加入100 jAg /mL LPS和各组的干 螺旋动脉异常舒张，是导致子宫异常出血的 (下转第20页) Http://Www.YaoKuo.Com/ 湖南中医学院学报 2005年第25卷 0.05)。处理1h和3h后10%拮新康血清+ADM组较正 异博定在80年代就被研究发现大剂量下能使长春 常血清+ADM组细胞内ADM浓度明显升高(P 0.05). 新硷的细胞毒性作用增强逆转抗肿瘤药物的耐药性，但 处理1h和3h后甲基莲心碱+ADM组和异博定+ADM 异博定毒性大，限制了其临床应用，寻找毒性小、作用强 组比ADM组显著升高(P 0.01)。处理1h和3h后甲 的MDR逆转剂有重要意义。本实验研究的中药拮新康 基莲心碱+ ADM组和异博定+ADM组比较无显著差异 毒性较低，对耐药白血病细胞的逆转作用强并且本身亦 (P 0.05)。各同一药物处理组1h和3h之间两两比较 有一定的抗肿瘤作用[[3]。因此认为中药拮新康应用于 无显著差异(P0.05)。 临床治疗白血病逆转肿瘤耐药是一个较好的药物。 3讨论 参考文献: 中药拮新康的主要成分莲子心，经现代药理研究证 [l l Notarbartolo M, Cervello M, Dusonchet L, et al. Resistance to 实其含多种生物碱成分，主要有莲心碱、甲基莲心碱、异 diverse apoptotic Triggers in multidrug resistant HIIW cells and 莲心碱等。莲心碱和甲基莲心碱属于异哇琳生物碱，具 its possible relationship to the expression of P-glycoprotein, Fas 有较强的钙离子拮抗活性[[71。钙离子拮抗剂通过竞争 and of the novel anti-apoptotis factors LAY (inhibitory of apop- 性抑制P- gp的外排功能而逆转MDR[a1。近年研究发现 tosis proteins) [J] . Cancer Lett, 2002,180(1) :91一101. 拮新康对白血病细胞有抑制作用，且具有一定量效关 [2l董 琳，唐小卿.甲基连心碱耐阿霉素人乳腺癌细胞内阿霉素 积累的影响〔J]中国药理学通报，2002,180):43-45. 系，并能逆转MDR和增强化疗的作用[[3]0 [3〕曹志红，谢兆霞，秦 群，等.中药拮新康对白血病细胞株的作 本实验研究发现，处理K562/A02细胞1h和3h之 用研究【il.中国现代医学杂志,2002,12(23):26-27. 后10%正常血清加ADM组和ADM组比较无差异(P L4]谢兆霞，谭达人，谢俊明，等.中药拮新康抗白血病细胞与免疫 0.05)，说明正常血清不影响K562/A02细胞内ADM的积 机能的研究〔Jl.湖南医科大学学报，1999,24(3):245-247. 累浓度。而经过10%拮新康血清处理K562/A02细胞1h [5〕黄程辉，谢兆霞，秦 群，等.中药拮新康复方对K562/A02细胞 和3h之后，细胞内ADM浓度较10%正常血清组明显增 的增殖及膜流动性的影响【Jl.湖南医科大学学报,2003,28(5): 加，表明拮新康可以增加K562/A02细胞内ADM的积聚 477-480. [6l黄程辉，谢兆霞，秦 群，等.拮新康逆转K562/A02细胞多药耐 浓度，逆转K562/A02细胞的MDR, 药的机理研究〔Jl.湖南中医学院学报，2004,24(1):7-10. 拮新康的有效成分甲基莲心碱处理1h和3h后的 [7〕潘竟先，陈志军，等.莲心钙拮抗活性成分的研究〔Jl.北京医科 K562/A02细胞内浓度较ADM组显著升高(P 0.01)，说 大学学报，1989,21(5):401-403. 明甲基莲心碱可以增加K562/A02细胞内ADM的积累浓 [81Hamilton G, Theyer G, Baumgartner G. Calcium antagonists as 度而逆转MDR。甲基莲心碱加ADM组和异博定加ADM modulators of multidrug resistant tumor cells [ J ].Wien Med 组比较无显著差异(P 0.05)，表明甲基莲心碱和异博 Wochenschr,1993,143(19-20) :58-60. 定有相似的逆转功效。 Http://Www.Caiyifa.Com/ (上接第13页)原因之一。炎症局部在致炎物和