Nature Methods | REEL分析：低辐射条件下的生物大分子元素定位革命

在现代生命科学研究中，揭示生物大分子的元素组成及其在三维空间中的分布是理解它们功能机制的关键。冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的广泛应用，使研究人员得以可视化复杂的大分子复合物的结构，从而获得前所未有的见解。然而，即使有了这样的技术，在精确定位某些关键元素时仍面临显著的挑战，尤其是金属离子、辅因子、底物和脂质等非蛋白质组分。这些元素在生物活性和细胞调控中扮演着至关重要的角色，比如在酶的催化作用、电子传递、以及维持结构稳定性等过程中起到重要作用。因此，精确确定这些元素的位置及其结合状态，对于深入理解生物大分子的机制是不可或缺的。

现有的冷冻电子显微镜单颗粒分析（single-particle analysis，SPA）在解析大分子复合物结构时，通常依赖大量的先验信息，比如肽链或核苷酸序列、键长和键角等来构建原子模型。然而，当涉及金属离子、辅因子和脂质等非蛋白质成分时，先验信息往往十分有限，导致结构解析存在较大的误差。据研究估计，蛋白质数据库（PDB）中的金属蛋白结构约有三分之一至一半存在金属离子定位错误，这不仅影响对大分子整体功能的理解，还可能导致对其生物化学性质的误判，从而对药物设计和疾病机制研究带来潜在影响。

目前，已有的一些元素分析技术如X射线荧光光谱、X射线吸收光谱和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等，虽然能够分析纯化复合物的元素组成，但它们无法区分元素是否特异性结合，也难以应对多个结合位点的复合物。此外，能量分散X射线光谱（EDX）和电子能量损失光谱（EELS）虽可以在电子显微镜中提供元素信息，但需要高辐射剂量，对于辐射敏感的生物样品来说会损伤样品的结构，从而影响实验结果。尤其是那些在特定环境下才能保持稳定的大分子，这种高剂量辐射可能会破坏它们的天然状态，使得测得的数据无法真实反映它们在生理条件下的实际情况。因此，开发一种既能保证样品完整性，又能实现高分辨率元素定位的新方法是非常必要的。

为了解决上述问题，10月24日Nature Methods的研究报道“Elemental mapping in single-particle reconstructions by reconstructed electron energy-loss analysis”，研究团队开发了一种称为重建电子能量损失分析（Reconstructed Electron Energy-Loss，REEL）的新方法。REEL结合了扫描透射电子显微镜（STEM）中的电子能量损失光谱（EELS）与类似于SPA的图像处理流程，通过对多个相同颗粒的光谱图像进行三维重建，以实现高剂量累积并精确定位大分子中的元素。该方法通过将多个低剂量图像的信息整合在一起，从而在不损伤样品的前提下实现了元素的高分辨率定位，这对于辐射敏感样品的研究极为重要。

在REEL方法中，研究人员首先使用扫描透射电子显微镜在低于100电子/平方埃（e^- Å^-2）的辐射剂量下采集冷冻保存的单颗粒样本的光谱图像。使用Titan Krios G3显微镜在200千伏加速电压下进行数据采集，配备常规的环形暗场（ADF）探测器和CEOS能量过滤及成像设备（CEFID）能量滤波器，并结合了后置的Dectris ELA混合像素探测器。为了减少采集时间，研究人员使用了高帧速率的探测器，每秒可读取1600万像素。这种高效的数据采集方式极大地降低了样品暴露在辐射中的时间，有助于保护样品的原始结构。

从光谱图像中提取无能量损失部分（即零损失部分），用于生成高强度的参考图像，以确定颗粒的坐标和重建姿态。通过参考图像，研究人员能够在整个能量损失光谱的每个能量区间生成三维重建，进而得到包含三维空间和能量损失维度的四维数据集。

重建电子能量损失分析（REEL）工作流程的步骤（Credit: Nature Methods）

光谱图像采集：在扫描透射电子显微镜-电子能量损失光谱（STEM-EELS）模式下，对冷冻保存的大分子复合物进行光谱图像采集，这些图像不仅包含两个空间维度（x和y），还包括能量损失维度（∆E）。

零损失部分提取：从光谱图像中提取零损失部分，用于生成弹性明场（EBF）图像，作为参考图像。利用这些参考图像可以确定颗粒的位置和重建姿态。

∆E图像提取与重建：从整个能量损失光谱的每个能量区间提取∆E图像，并将参考图像确定的颗粒坐标和重建姿态应用于这些图像，实现每个能量损失的体积重建，从而生成具有三个空间维度和一个能量损失维度的四维数据集。

本地光谱生成：通过绘制特定体素或体素区域的值与能量损失的关系，可以生成本地光谱，用于进一步分析。

成功验证：从兔子Ryanodine受体1到蚯蚓血红蛋白

研究人员通过两种测试样本——兔子的Ryanodine受体1（RyR1）和蚯蚓血红蛋白（WH）——验证了REEL方法的有效性。通过REEL分析，研究团队成功地将特定元素信号映射到大分子的三维结构中。例如，在RyR1的重建中，研究人员检测到了碳、氧、氮等主要元素的特征边缘，这些信号与已知的分子结构分布高度一致，证明了该方法的准确性和可靠性。这些元素信号的成功检测为进一步研究这些元素在大分子中的功能提供了基础，尤其是在深入探究金属离子和其他关键元素如何影响大分子行为方面。

具体来说，在对RyR1的分析中，研究人员通过检测碳元素信号来明确其分布，并结合已知的结构信息，发现这些碳元素主要集中在蛋白质骨架区域和辅因子的结合位点附近。氧元素的检测结果则显示出它在参与氢键网络和水分子结合中的重要作用，这些特征对于维持RyR1的整体结构稳定性至关重要。氮元素信号的分布也表明，其在构建蛋白质骨架及与配体相互作用中具有不可替代的作用。这些数据的获取使得科学家们能够更加深入地了解大分子内部的元素组成和功能。

此外，研究团队对每个体素进行了详细的背景扣除，以确保获得特定元素的可靠信号。对于碳元素，信号在碳K边缘的显著开始点明确表明了元素信号的强度足够在背景噪声之上显现。经过背景扣除后，碳信号显示出蛋白质区域和溶剂区域之间的明显差异，清晰地反映了元素在大分子复合物中的特异性分布。这种精细的元素分布图不仅揭示了大分子中不同区域的化学特性，还为理解这些元素在生物大分子中的具体角色奠定了基础。例如，碳在酶的活性中心参与了催化反应，而氧则通过参与氢键和其他弱相互作用，帮助维持大分子的空间构象。

通过对蚯蚓血红蛋白（WH）的分析，研究人员进一步展示了REEL方法在复杂多亚基复合物中的应用潜力。WH是一种大型寡聚蛋白复合物，包含多个血红素亚基和非血红素辅因子。通过REEL，研究人员能够精确地定位这些血红素和辅因子的位置，从而为理解WH的氧运输机制提供了新的视角。具体而言，REEL分析显示，血红素亚基的位置与氧结合的区域具有高度重叠，这为理解WH如何高效结合和释放氧气提供了重要的结构依据。此外，非血红素辅因子的定位也揭示了它们在稳定复合物结构和辅助氧运输过程中的重要性。这种能力对于研究其他具有多种辅因子的大分子复合物同样具有重要意义，特别是在解析其功能时，例如金属辅因子如何在催化过程中起到关键作用。

此外，研究人员还通过对不同亚基的元素分布进行比较，发现了WH中不同亚基在功能上的分工与协作。REEL方法揭示了血红素亚基之间的相互作用，以及这些亚基如何通过辅因子的协助实现氧的高效运输。这些发现为理解多亚基复合物的协同性和调控机制提供了重要信息，特别是在涉及氧运输、电子转移以及其他重要的生物过程时。

总之，通过对RyR1和WH的详细分析，REEL方法展示了其在生物大分子结构解析中的强大潜力，特别是对于揭示关键元素的空间分布及其在生物大分子功能中的作用方面。REEL方法不仅验证了其在复杂生物系统中的有效性，还为未来研究复杂大分子复合物中的元素功能提供了新的工具和方法。随着技术的进一步改进，REEL有望在更广泛的生物系统中得到应用，尤其是在需要精确定位关键元素以理解其功能的研究领域中。

REEL方法的优势与局限性

REEL方法的一个显著优势是其在低辐射剂量下进行三维元素映射的能力，尤其适用于冷冻保存的生物样品，这些样品通常对辐射极为敏感。传统的高剂量方法往往会对样品造成不可逆的损伤，影响其原始状态。而REEL方法通过累积低剂量图像信息，能够在保护样品的同时获得高分辨率的元素信息。此外，REEL还可以检测到许多常见的轻元素（如碳、氮、氧），这些元素在传统X射线衍射分析中无法通过异常散射信号检测到。

然而，目前REEL方法尚未达到单原子水平的敏感性。尽管在实验中累积的有效剂量已超过单原子检测所需的最小剂量，但由于样品中冰的背景信号较强，以及单颗粒对准精度的限制，导致敏感性不足。因此，未来需要提高图像质量和数据集规模，以进一步提升方法的分辨率和灵敏度。此外，样品的制备质量也是影响REEL成功的关键因素之一，任何冰污染或样品的不均匀性都会对最终的重建结果产生显著影响。因此，在未来的发展中，需要优化样品的制备流程，以确保高质量的数据采集。

潜在应用与未来发展

随着技术的不断进步，REEL方法在元素映射领域展现出巨大的应用潜力，尤其是在研究生物大分子复合物的结构和功能时。例如，通过检测金属离子、轻元素和脂质的相互作用，REEL可以揭示离子通道和转运蛋白的工作机制，甚至是瞬态相互作用，这对于理解膜蛋白的功能至关重要。离子通道中的金属离子，如钙离子和钠离子，通常在信号传导和电位调节中发挥关键作用，而REEL可以帮助精确定位这些离子，从而更好地理解它们在细胞活动中的功能。

未来，研究团队计划在以下几个方面改进REEL方法：首先，提高数据采集速度并增加数据集的规模，以提高元素检测的灵敏度；其次，结合其他先进成像技术（如STEM相位检索方法）以进一步提高分辨率；最后，使用更快的探测器以实现更高的采集速度，减少辐射损伤的累积效应。通过这些改进，REEL方法有望实现对单原子水平的元素定位，这将为理解许多生物过程提供前所未有的细节。此外，结合机器学习算法进行自动化数据处理和分析，也将极大地提升REEL的效率和适用性，特别是在处理大规模数据集时。

总之，REEL分析为元素的三维定位提供了一种新的技术手段，特别适用于辐射敏感的冷冻生物样品。随着这一技术的进一步发展，我们有望更深入地理解大分子复合物的结构和功能，这将为生物化学和结构生物学领域提供重要的工具和方法。通过与其他结构生物学技术的结合，如冷冻断层扫描（cryo-ET）和核磁共振（NMR），REEL将能够提供更为全面和多尺度的信息，帮助我们揭示从单个原子到复杂生物网络的各种生物学现象。未来，REEL方法在药物设计、生物催化剂开发以及基础生命科学研究中的应用前景广阔，将极大地推动我们对生命系统的理解和探索。

参考文献

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02482-5