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期刊要求WB整张凝胶下载_国家为什么不承认阴滋病(2024年11月最新版)

内容来源：合毅科技所属栏目：新闻更新日期：2024-11-27

期刊要求WB整张凝胶

WB实验注意事项：从样品准备到加样技巧 ### 蛋白样品准备 𐟧ꊦ 𗥓质量首先，确保你抽取的蛋白样品质量过关。蛋白含量要足够，变性要充分，PH值最好在7~8之间。这些都会直接影响样品浓缩的效果。此外，还要注意蛋白样品是否降解，目的蛋白是否已经充分抽取。细胞水平WB 如果你需要在细胞水平做WB，通常5㗱06个细胞提取的蛋白就足够用了。小分子量蛋白（10KD）选择孔径0.22um的PVDF膜或NC膜，转膜时间可以缩短。你也可以选择Tricine-SDS-PAGE体系。选择PSQ膜，同时缩短转移时间。或者将两张膜叠在一起再转移。其他步骤按常规操作即可。大分子量蛋白（200KD）做200KD蛋白的WB时，分离胶最好选择>7%的。剥胶时要特别小心。转移时间需要相应延长，并且最好做分子量参照，否则出现杂带不好分析。转膜液中甲醇含量可以适当降低，推荐使用湿装转膜，效率更高。制胶 𐟧𔊥‡胶质量不连续SDS-PAGE对凝胶的要求较高。分离胶的PH值应在8.8左右，浓缩胶的PH值应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位。这是因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶时所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。加水压胶时的问题加水时要沿着玻璃板缓慢流，不能对着胶冲。加水满后一定要保证上方水平面是平齐的。加胶时要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固。有人用异丙醇封胶后左右晃一下，效果更好。加样 𐟒‰ 点样技巧样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩效果。因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。建议用长枪头或加样器，轻轻将样品加到孔的底部。增加上样量如果上样量超载，可以浓缩样品，或者根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，试试1.5mm的。希望这些小贴士能帮到你，让你的WB实验更加顺利！𐟔쀀

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

WB实验优化指南：提高效率与安全性 ### 凝胶制备的优化 𐟧ꊊ传统的WB实验中，凝胶制备是一个繁琐的过程。其实，你可以提前将去离子水、30% Acr-Bis、Tris、10% SDS、TEMED 等试剂混合在一起，保存在4Ⰳ避光的地方，有效期可达一个月或更长时间。这样，整个制胶过程就简化为了只需添加一种试剂。另外，为了方便上样，可以在上层胶中加入染料指示剂，形成预染胶。当然，你也可以选择使用商品化的制胶试剂盒，虽然价格稍高，但操作更简便。电泳缓冲液制备的优化 𐟌Š 电泳缓冲液的配方也有优化的空间。传统的配方在高电压下会出现蛋白质信号丢失的问题，而且不能明显缩短电泳时间。经过优化后的配方（Tris 38.1 mM、甘氨酸266.7 mM、HEPES 21.0 mM、SDS 3.5 mM、pH 8.3），可以在室温、200 V、35 min内完成电泳，并且高效分离小分子蛋白。300 V时仍能正常电泳，但电压过高容易产热，需要冰浴降温。建议配置5X的电泳液备用，因为1㗧”𕦳𓧼“冲液室温保存后容易发生絮凝。转膜液制备的优化 𐟌€ 在WB实验中，甲醇的毒性是一个大问题。其实，你可以用无水乙醇来替代甲醇配制转膜液。这样一来，所有需要用甲醇的地方都可以用乙醇替代（包括膜的活化和转膜液的配制）。为了自己的健康，做实验时，能用低毒或无毒的试剂替代时，一定要替代，不要因小失大！转印膜选择的优化 𐟓„ 转印膜的选择也会影响实验结果。0.45 ⵭ NC 膜比 0.45 ⵭ PVDF 膜更好地拦截蛋白质标记染料。对于小分子量蛋白，0.22 ⵭ PVDF膜的截留能力明显强于0.45 ⵭ PVDF膜和0.45 ⵭ NC膜。一直以来，0.22 ⵭ PVDF膜都是首选，因为它不会让小分子蛋白转过。凝胶切割的优化 ✂️ WB条带是论文造假的重灾区。每年都有无数论文因蛋白质条带而在PubPeer上受到质疑。渐渐地，一些期刊开始提倡使用未切割的凝胶。未切割的凝胶虽然增加了工作量，但可以确认相应分子量的目标蛋白并验证一抗的特异性。另外，条带太宽也不是什么好事，这样会增加非特异性条带的产生。通过这些优化方法，你可以提高WB实验的效率、安全性和准确性。希望这些建议对你的实验有所帮助！

nc膜有正反吗在进行WB实验时，选择合适的膜材料至关重要。PVDF膜和NC膜是两种常见的选择，它们各有优缺点。以下是它们的详细比较： PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）蛋白质截留能力强：与NC膜相比，PVDF膜具有更强的蛋白质结合能力，结合强度是NC膜的6倍。机械强度和化学耐受性：PVDF膜具有更好的机械强度和化学耐受性，适用于各种染色应用和多重免疫检测。单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测。多种孔径选择：PVDF膜有多种孔径可供选择，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20kD的蛋白选用0.45的膜，小于20kD的蛋白选用0.2的膜。 NC膜（硝酸纤维素膜）操作简便：NC膜使用方便，操作简单，兼容多种检测方法。与PVDF膜相比，不需要甲醇浸泡过程，适合在亲水环境下进行蛋白质转移。在转移前，仅需要在水中简单润湿，然后置于转移缓冲液中，不需要其他的预湿步骤。低背景：NC膜本身产生的背景非常低，膜特有的表面性质保证了优异的信噪比，在膜洗脱时不需要严格的洗脱条件。小分子蛋白的高截留率：NC膜有多种孔径以供选择，按照不同的使用要求进行选择相应的孔径的膜： 0.22的NC膜通过小孔径来截留分子量小于20kD的蛋白质分子。 0.45的膜是较大分子蛋白和核酸的理想选择。 0.1的膜常用于分子量小于7kD的蛋白质。保质期更长：NC膜的保质期更长，可保存五年。选择合适的膜材料对于WB实验的成功至关重要。希望这些信息能帮助您做出明智的选择。

WB实验内参跑得整齐的秘诀大家好，今天我来分享一些关于WB实验内参跑得整齐的小技巧，希望对你们有帮助！提总蛋白的小技巧 𐟧ꊥ†𐤸Š操作：提取总蛋白时，一定要在冰上操作。如果一次用不完的样本，记得保存到-80℃，避免蛋白降解。吸取干净：每次吸取样本时，吸得干净一些，减少干扰。准确蛋白定量 𐟓 通过BCA法确定每孔的上样量和体积，不要随意上样。控制煮蛋白的时间和温度 ⏲️ 将Buffer按计算量加入含有蛋白的EP管，煮蛋白时间不能过长，加热完成后及时插入冰中。选对凝胶及浓度 𐟧𔊦 𙦍†子量大小选择合适的凝胶和浓度。凝胶浓度越小，孔越大，较大的蛋白质更容易通过较大的孔。制胶及拔梳子时避免气泡。选择合适的膜 𐟕𘯸 常见的PVDF膜有0.2um和0.45um。较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。转印过程中的注意事项 𐟔„ 电泳及转膜过程中设置的参数要适合自己的分子量。 PVDF膜用甲醛激活前不可以沾水，保持干燥。做好标记，区分正反，避免转印错误。跑电泳时多跑一点，跑到目的蛋白胶下缘1cm左右，减少切胶失误。转膜时黑胶白膜，红对红黑对黑，提前预冷。一抗孵育 𐟦 将封闭好的PVDF膜置于塑料膜内，塑料膜做成小袋。将一抗用牛奶稀释。Actin：一抗：牛奶=1:2000；目的蛋白：一抗：牛奶=1:1000。 4℃摇床过夜。二抗孵育 𐟦 回收一抗。 TBST洗膜，三次，每次10min，摇床。二抗：牛奶=1:5000，与膜接触。摇床，室温，2小时。显影 𐟓𘊥›ž收二抗。洗膜，TBST三次，每次10min。显影液，A液：B液=1：1，避光。显影。

一周搞定WB操作：拒绝摆烂，从这里开始！大家好，今天我想和大家聊聊WB实验的那些事儿。作为一个过来人，我深知摆烂的痛苦，所以特地整理了一份详细的WB操作指南，希望能帮到你们。一、WB实验的目的 𐟎斥…ˆ，咱们得搞清楚为什么要做WB实验。简单来说，就是用RIPA或Laemmli Sample Buffer液提取蛋白，通过Western blot检测特定分子的表达情况。二、WB实验的原理 𐟧슨🙤𘪩ƒ襈†有点技术含量。简单来说，WB实验通过SDS-PAGE电泳分离不同分子量的蛋白，然后把这些蛋白从凝胶转移到固相支持体上，再用针对特定分子的抗体进行免疫反应，最后通过化学发光和成像来检测目的分子。三、实验材料 𐟧ꊥš实验当然少不了材料。你需要准备一些试剂、耗材和仪器。具体清单就不细说了，大家可以根据自己的实验室条件来准备。四、实验方法 𐟓 接下来是具体的操作步骤： SDS-PAGE电泳：这一步很关键，配胶的时候要注意加水的顺序。转膜：把电泳分离的蛋白从凝胶转移到固相支持体上。免疫反应与化学发光和成像：最后一步就是免疫反应和成像了。五、实验注意事项 ⚠️ 这里有几个小贴士：配胶时，建议先加水，再加其他成分。转膜的时候要小心，别弄坏了膜。曝光时多使用ECL发光试剂盒，注意操作时间。希望这些小贴士能帮到你们，拒绝摆烂，我们一起加油！𐟒ꀀ

实验室毒物大揭秘！𐟔𐟒€ 实验室里，那些看似神奇的化学试剂，其实隐藏着不小的危险。今天，我们就来聊聊那些让人闻风丧胆的有毒试剂。 DMSO（二甲基亚砜）𐟧ꊄMSO常用于冻存液的配置，也是许多粉剂的溶剂。然而，它具有血管毒性和肝肾毒性，使用时一定要小心。 EB（溴化乙锭）𐟧슅B是琼脂糖凝胶电泳中的核酸染料，具有致癌性。在我们学校的仪器平台，使用EB时甚至不允许显影，因其毒性极强。 PCR实验中的有毒试剂𐟧𜊐CR实验中使用的苯、二甲苯、酚、trizol、氯仿等有机溶剂都有致癌风险。DEPC（焦炭酸二乙酯）用于溶解RNA，是潜在的蛋白质变质剂。进行PCR实验时一定要戴好口罩。 WB实验中的危险试剂𐟧ꊗB实验中使用的PMSF用于蛋白提取，具有高强度毒性；SDS（十二烷基硫酸钠）用于SDS-PAGE电泳凝胶配置，具有刺激作用，可能引起呼吸系统过敏性反应；丙烯酰胺（未聚合）作为蛋白电泳凝胶原料，具有潜在神经毒性；TEMED（四甲基乙二胺）用于SDS-PAGE凝胶配置，能催化凝胶凝固，易挥发，且具有强神经毒性。 Triton x-100𐟧𔊔riton x-100具有刺激性，可能因吸入或者皮肤吸收而使人受害。多聚甲醛𐟧ꊥ䚨š甲醛应用于组织固定灌流，易挥发且属于剧毒物质。 DTT (二硫苏糖醇)𐟧ꊄTT是一种小分子有机还原剂，会散发出难闻的气味。可能因吸入、咽下或者皮肤吸收而危害健康。吉姆萨 Giemsa𐟧ꊥ‰姆萨染料毒性极强，可能致命或者导致眼睛失明，能够通过吸入和皮肤吸收进入人体，其可能造成的危险具有不可逆的效应。过硫酸铵APS𐟧ꊨ🇧᫩…𘩓𕥯𙤺Ž黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤具有极大的危害性。吸入甚至可能致命。甲醇𐟍𗊧”𒩆‡有毒性，致命剂量约为70毫升。甲醇的毒性对人体的神经系统和血液系统影响最为显著，不论是经消化道、呼吸道还是皮肤摄入，都会产生毒性反应。甲醇蒸汽会损害人的呼吸道粘膜和视力。因此，要佩戴好防毒面具和护目镜，避免接触其蒸汽，并注意在通风橱内进行操作。乙醚𐟧ꊤ𙙩†š是一种高度挥发，遇明火、高热极易燃烧爆炸，并具有特殊气味的液体。其化学性质不稳定，在日光下与空气接触，易形成爆炸性过氧化物过氧化乙醚。使用时应倍加小心。乙醚广泛用作麻醉剂。 𐟌Ÿ进入实验室时，一定要严格遵守安全规定，戴好防护用具，手套、护目镜一个都不能少！𐟒–生命只有一次，千万不能掉以轻心！让我们一起远离危险，保护好自己！

实验室摇床选购指南：别盲目跟风！实验室摇床是进行各种生化实验的必备工具，选择合适的摇床至关重要！以下是不同类型摇床的适用场景，帮你做出明智选择： 1️⃣ 圆周摇床 𐟒ᠩ€‚用于凝胶电泳实验、考马斯蓝染色/脱色、硝酸银染色的固定/染色/显影、Southern blot中DNA变性等。 2️⃣ 线性摇床 𐟒ᠩ€‚用于化学提取、生化反应、血样混合、脂肪混匀、凝胶染色、细胞培养、溶度研究等。 3️⃣ 翘板摇床 𐟒ᠩ€‚用于电泳凝胶染色/脱色样品洗涤、酶联免疫吸附（ELISA）洗脱、酶促免疫检测、蛋白合成、杂交印迹/洗脱、免疫沉淀、WB实验等。 4️⃣ 三维摇床 𐟒ᠩ€‚用于剪切力敏感、对氧气需求量较低的细胞培养，如哺乳动物细胞培养，精细的细胞培养、染色和脱色。选择合适的摇床能让你的实验更加高效和准确，记得根据实验需求来选购哦！

WB实验内参双条带？原因及解决方法详解嘿，做WB实验的小伙伴们，你们有没有遇到过内参双条带的情况？别急，这种情况其实挺常见的。先来分析一下可能的原因吧。内参蛋白降解 𐟧ꊩ斥…ˆ，内参蛋白降解是一个常见的原因。所以在裂解细胞的时候，一定要记得及时加入蛋白酶抑制剂，不然内参蛋白就会被降解了。多克隆抗体的问题 𐟐𐊥†…参抗体如果是多克隆的，那就要注意了。这种抗体本质上是一个抗体混合物，容易和其他蛋白的抗原位点结合，从而产生杂带。你可以试试在4度摇床上过夜孵育，或者稀释抗体的浓度来降低杂带的概率。有条件的话，还是选单克隆抗体吧，虽然价格贵点，但效果更好。凝胶和电泳液的问题 𐟓Š 凝胶和电泳液的pH值也很重要，它会影响蛋白的迁移和分离。所以一定要把控好pH值，确保实验条件最佳。胶片曝光时的操作 𐟓𘊧”訃𖧉‡曝光的小伙伴们注意了，操作时千万别让胶片位移，不然也会导致双条带哦。抗体剥离不完全 𐟧ꊥ悦žœ你在孵育内参前剥离过抗体，而且内参和目的蛋白的分子量接近，那没剥离完全就会显出之前的条带。所以剥离抗体时要小心，确保完全剥离。抗体污染 𐟧ꊩ‡复使用内参抗体会增加污染的几率，也会导致双条带。所以尽量不要重复使用抗体，确保实验的准确性。这些原因可能同时出现，所以做实验前一定要逐一检查排除，这样才能确保实验顺利进行。希望这些小贴士能帮到你们！𐟒ꀀ

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