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全膜时代,WB实验成本飙升! 什么是全膜? 很多人误以为全膜就是所有蛋白都在一张膜上跑,但实际上,全膜指的是用显影仪拍照得到的图片,未经任何裁剪、拼接等处理。一些期刊要求全膜必须包含分子大小标记物,甚至在特定情况下需要阳性和阴性对照。例如,期刊J CELL BIOCHEM就明确要求这一点。(图2,图片源于Journal of Molecular Medicine-JMM) 为什么要全膜? WB实验在生物学领域容易造假,有些人为了得到预期的实验结果,会直接转染过表达质粒或shRNA质粒来控制蛋白表达量。更离谱的是,有些实验室甚至直接更改蛋白名字,将A蛋白的数据结果改为B蛋白。这些“骚操作”迫使各大杂志要求提供全膜材料,以减少数据的不真实性。 全膜的成本增加 更换为全膜后,实验室的成本大幅增加。首先,抗体消耗是WB实验的主要成本之一。虽然抗体成本在逐步降低,但更换为全膜后,抗体使用量可能是之前的2-3倍,导致成本呈指数型增长。 其次,在裁膜时代,一张膜可以最大化利用,可能检测多个指标。换为全膜后,一张膜只能检测一个指标。这不仅增加了时间成本,还增加了试剂成本。例如,制备凝胶、电泳、转膜等过程中所使用的试剂成本也在大幅增加。总体下来,成本可能是之前的3-5倍。 最后,还有人力成本。正常一个WB实验从制备样本到完成检测,再到最后的显影结束可能花费2-3天。现在不论是使用抗体剥离液还是一张胶只进行一个抗体指标的检测,都会大幅度提高人力成本。 总结 综上所述,WB实验更换为全膜后,一次实验的成本可能是之前的5倍左右。同时,时间花费也会是之前的2-3倍,甚至更多。这不仅会增加实验室的成本,还会让研究生们花费更多时间进行实验。在研究生涯中,这无疑是一笔额外的负担。
WB实验新手必看:电泳、电转和封闭全攻略 电泳技巧: 在WB实验中,电泳是关键的一步。建议使用66V恒压进行电泳,这样跑出来的条带会非常美观。 电转操作: 对于大分子量的蛋白质(超过100KD),建议使用10%的甲醇,因为甲醇浓度过高时,小分子量(小于20KD)的蛋白质容易转出。 小分子量的蛋白质则可以使用20%的甲醇,如果分子量在20以下,建议使用0.22uM的PVDF膜。注意,很多期刊要求整张膜进行WB敷,因此在开始实验前要确定好目标期刊的要求。 封闭过程: 磷酸化指标通常需要使用BSA进行封闭,有时还需要用TAE或其他试剂调节pH。实际上,使用普通的5%BSA粉末封闭也可以得到漂亮的条带。如果目标是发表高分文章,可以尝试调整pH。 普通指标可以使用5%的脱脂奶粉进行封闭。 ✂️ 切膜技巧: 这一步非常关键,必须提前熟悉自己指标的分子量。熟悉分子量可以帮助你更准确地切膜,从而提高实验的准确性。
我与国奖擦肩而过的那些年 研三的我,在近千人的硕博生中,以62.4分的积分位列第三,与国奖失之交臂。回首过去,不禁感慨万千。 研0:初入学术殿堂,多看多做 获取文献的能力:初入一个新研究领域,可以先从中文的985、211高校的硕博论文开始,了解这个领域的基本术语和未解决的问题。然后利用Web of Science、Pubmed等权威学术网站查找英文文献。 阅读文献的能力:我喜欢用笔记记录文献的题目、作者、单位、期刊、摘要及重要内容。好记性不如烂笔头,方便后续查阅。 整理文献的能力:学会使用Endnote等文献管理工具,快速筛选精读和泛读的文章。 研1:潜心基础研究,提升科研思维 实践锻炼思维:参与研究生大创项目和老板的科研项目,了解项目逻辑对文章逻辑的帮助。 学习实验三板斧:掌握细胞、PCR、WB等基本实验技术,走遍天下都不怕。 数据处理能力:Stata、SPSS、Python都是专业的统计分析软件,可以去看相关的统计课程。 科研绘图能力:GraphPad和AI是常用的科研绘图工具。先用GraphPad做单个统计图,再用AI作模式图,最后将单个图形拼成SCI论文里的figure。 研2:专心写作 建立写作计划:收集信息、设定主题和目标。基于前期文献和数据积累,确定题目。 执行写作计划:反复阅读和模仿他人文章,堆砌成一篇完整文章。 整理文献逻辑:写好前沿和讨论部分。这需要反复琢磨修改,可以考虑从中文写到英文。 整理文章:借助在线写作软件润色文章。 研3:学习计算机技能,科研加分 计算机技能真的非常强大,能帮助我们抓取和处理重要数据和信息。对于即将工作或读博的学生来说,学习计算机技能可以大大提高产出效率。具体学习步骤可以再交流啦。 希望这些经验能对师弟师妹们有所帮助!
AI新手秘籍,秒变高手! 如果你正在寻找一款强大的矢量图形处理软件,那么Adobe Illustrator绝对是你的不二之选。这款软件和Photoshop是兄弟软件,被誉为设计软件的两件套。今天,我就来分享一些使用Illustrator的小技巧,帮助你快速上手。 新建文档 首先,打开Illustrator,点击“文件”菜单,选择“新建”或者直接点击主页上的“新建”按钮。在新建文档对话框中,你可以设置各种参数,比如文件名、宽度和高度、单位、方向(纵向或横向)、画板数量和出血值等。设置完毕后,点击“创建”即可完成新建空白文档。 打开文档 打开文档有两种方法: 直接拖动图片文件到Illustrator图标上。 点击“文件”菜单,选择“打开”,或者点击主页上的“打开”按钮。后缀为.ai的文件,双击即可打开。 置入文档 通过置入功能,你可以将新的图形文件添加到已经打开的文件中。具体操作如下: 点击“文件”菜单,选择“置入”。 选中需要置入的文件后(按住Ctrl键或拖动鼠标可选择多个对象),点击“置入”。 拼图演示 有时候,我们需要将多个小图拼成一个完整的图片。以下是具体步骤: 根据期刊要求新建一个文档。如果期刊要求颜色模式为RGB,则先点击“移动设备”或“Web”,再修改右边的参数;如果期刊要求颜色模式为CMYK,则先点击“打印”,再修改右边的参数。 置入并嵌入提前准备好的小图,大致排放好位置。在Photoshop中设置了描边的小图,需先在Photoshop中隐藏描边效果(点击效果前面的眼睛图标隐藏)。对于PSD文件,点击“嵌入”时会弹出选项框,点击“将图层转换为对象”。 对于置入的PDF文件,通过取消编组和释放剪切蒙版,使小图中的每个对象可单独选中;对于PSD文件,只需点击释放剪切蒙版,再选中后面的白色背景删去即可。这里以PDF文件为例:选中图像,右键打开快捷菜单,点击“取消编组”。再选中图像,右键打开快捷菜单,点击“释放剪切蒙版”。把光标移动到图像边缘处,出现蓝色路径时点击选中,点击Delete键删去后,再重复一次。 选择“矩形工具”后,把光标移动到条带的左上角,会出现粉红色的锚点,点击并按住拖动,在智能辅助线的帮助下,绘制无填充色、1pt粗细黑色描边的矩形作为条带的描边。也可先选中WB条带,点击“蒙版”,再修改描边颜色为黑色,粗细为1pt。选中柱状图中的线条,将描边粗细改为1pt。 总结 Adobe Illustrator是一款非常强大的矢量图形处理软件,掌握它的基本操作可以让你事半功倍。希望这篇指南能帮助你快速上手并创作出精美的作品!
文章被拒的背后原因,竟然是这个!𑊦近投了一篇论文,本以为稳了,结果却被拒了。仔细一想,好像发现了原因所在。 首先,文章最好不要送到中国某个编辑手里。虽然这个编辑在国际上很有名,但在我们领域,只要送到他手里的文章,几乎都被拒了。 可能是他在我们这个领域里有点挑剔,或者说是对国内的研究不太感兴趣。 之前有一次,我投的这个期刊,编辑是外国人。审稿人觉得我的论证不够严谨,给了拒稿意见,结果就被拒了。于是我又补了一些qPCR和WB实验的数据,重新完善了论文,标题也改了。没想到这次直接在编辑手里就栽了。 和师姐一起研究了一下我们实验室历年来投这个期刊的情况,发现被拒的主要原因有两个:一是送到中国某个编辑手里,二是送到韩国编辑那里。 我上一篇文章也是投的这个期刊,编辑是外国人,当时给我送审了,大修后也接收了。实验室的一个师姐前段时间也是一个外国编辑,送审并接收。看来不同编辑的审美和要求还真是千差万别。 真是让人头疼啊!这是我觉得最合适并且很有把握的期刊之一,一直对中国人很友好(中国人自己办的期刊),而且是一区top期刊。怎么才能避开这个编辑再投呢?(我做不到让某个编辑满意,肯定是我的研究不够吸引他,但换个编辑可能就是另外的故事了)
WB实验:内参与目的蛋白同膜共存 젗B实验,即Western blot,是一种常用的免疫印迹技术,用于检测蛋白质的存在和表达。近年来,期刊对实验的要求不断提高,尤其是内参和目的蛋白需要在同一张膜上显示。 现在,通过先进的实验技术,完全可以在同一张膜上同时显示内参和目的蛋白,甚至双带也可以与内参共存。
五年的本科生涯,你该如何度过? 回首过去的五年,仿佛一切都历历在目。2024年9月9日,我决定记录下这五年的时光,或许能给你未来的道路提供一些参考。 大一时,我懵懵懂懂地开始了这段旅程。大二时,我开始追求实验室研究,因为我没有其他突出的地方。我跟着研究生学习了养细胞、WB、ELISA等实验方法。大三时,我跟随导师申报了一个小课题,大四时在核心期刊上发表了人生第一篇论文。 五年的时光匆匆而过,专业课的学习并不理想。我们在学校的好时候错过了,专业基本功并不扎实。在口腔内科实习轮转时,带教老师对我的嘲讽让我备受打击。但无论如何,我还是坚持了下来,希望在口腔方向就业。 我是否想考研究生呢?或许有些想法,但论文已经写了。我知道研究生之路的孤单和无聊,甚至可以说是压抑。我讨厌科研,但本科科研的导师对我非常好。如果研究生导师不好,要我天天加班做实验、看文献、准备PPT开组会等,我十分厌恶这种生活。科研压力加上规培压力,我真的难以独自承受。 所以,我根本没有打算走研究生这条路。考研裸考总分加起来只有150分。我认为临床应该是一个纯净的环境,不能既要又要,既要规培好好学习临床知识和技能操作能力,又要满足医学院那边的导师的科研要求。 值过住院部的夜班,让一个住院医师从早上八点半查房一直呆到第二天十二点下班,36个小时对夜班医生来说家常便饭,这种生活在三甲医院比比皆是。我不想这样活着,太累。双休要值班,节假日要值班,我是人,不是工具,也不是AI,为什么要这么卷?我的工资哪怕比别人低一点,我也不想去卷。 很多医学生卷考研这条赛道,如果是自己内心有明确的目标那还好,但如果是随波逐流地去跟着大部分人“考研”,考研的路上煎熬死,考上读研的过程痛苦死,择业时如果没好的校招企业,你还得去卷考公考编这条赛道,这样,不累么?为了研究生这个大部分人看起来是必经的路,然后直接舍弃掉本科校招的机会,考不上又得去考规培,或者二战、三战、四五六七八战? 于是我下定决心就业。很幸运,校招签了一个普普通通的小二甲。或许以后也会有后悔没有考研的想法出现。但那是以后了。
WB实验难?10招提高成功率! 经常做 Western blot 的朋友们,你们是否也有过这样的困惑?每次实验都像是开奖,结果总是让人捉摸不透。十个 WB 实验,七个失败,八个丑陋,九个出问题,还有一个完全不出结果。条带失踪、背景漆黑、杂带丛生……这些问题简直让人崩溃。 有时候,即使你凑齐了所有的“天时地利人和”,也不一定能得到一组完美的条带。江湖传言,一个生物学博士要跑满 1000 块胶才能顺利毕业。WB 实验本身就很难,再加上“造假”、“撤稿”、“学术不端”等丑闻,使得主流期刊对 WB 数据的要求越来越高,甚至要求作者提供原始数据和未切割的 WB 全膜条带。 对于那些出道已久的“老博士”来说,WB 的“玄学”操作早就积累了一本厚厚的攻略。今天,我就来分享一些精华内容,帮助大家提高 WB 实验的成功率,让你的条带显露真身。 跑胶是 WB 实验成败之母 提高跑胶质量的 Tips 蛋白分子量偏高或偏低 슥糖𝦘糖𖧚浓度与目的蛋白的浓度不对应。比如说,你用 12% 的胶跑 100KD 的蛋白,或者用 8% 的胶跑 20KD 的蛋白。 蛋白质降解 𑊨白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后出现一些其他带。最主要的特点是所有的条带都比正常的低,并且条带模糊不清晰。 所有条带连成一片无间隔 最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。 溴酚蓝拖尾 篸 样品溶解不好或上样前未变性完全。 纵向的纹理 上样样品中存在不溶性颗粒。 溴酚蓝很粗 𓊦𖦵缩效果不好,可能是浓缩胶太短或者配错。 在分离胶中跑不动 ️ Tris-Cl pH 值不对,或者忘记加 SDS。 一抗加成其他抗体或二抗种属加错 𐊥悦 marker 正常,其他位置没有条带,最可能是一抗加成其他抗体,或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的。 解决办法 目的蛋白完全无信号,但同时做的内参是正常的,那么大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗。 目的蛋白和内参均无信号,则考虑是否发光液失效。如果膜上没有 marker 则为转膜失败。 如果中间出现了细微条带,可能是蛋白上样量太少,或一抗浓度过低。 经验之谈 如图所展示的,一点信号都没有,大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带,可能是蛋白上样量太少,一抗浓度过低,ECL 发光液失效。 希望这些小技巧能帮助大家在 WB 实验中少走弯路,提高实验成功率!ꀀ
为什么发表SCI论文需要这么长时间? 发表一篇SCI论文的过程之所以漫长,主要是因为不同分区的SCI期刊对科研工作量的要求差异巨大。 一、二区SCI期刊的影响因子通常在5分以上,对论文的要求非常高。它们不仅需要高水平的研究成果,还要求论文具有较高的创新性和严谨的论证。实验设计、数据分析和结论论证都需要经过严格的审查,这无疑增加了实验成本。 젧𘦯之下,三、四区SCI期刊的影响因子多在0-3分之间,对文章的要求相对较低。它们对研究创新性和影响因子的要求没有那么严格,使得发表过程相对容易一些。 表一区、二区的高分SCI论文,科研团队需要对文章的科学问题进行深入的研究。文章的内容需要具有创新性,涉及新的研究技术或新的交互关系。为了验证这些科学假说,科研团队需要进行大量的探究性实验,利用生物信息学、临床研究、分子生物学、细胞生物学以及动物模型等多维度进行探究和验证。 一区、二区期刊的SCI论文往往涉及复杂的交互因子,需要对科学假设进行不少于4组的因果逻辑论证。最终的结果需要通过至少5个组图在论文中进行呈现。例如,在细胞水平探究某lncRNA调控某蛋白的转录活性和表达时,一张figure可能就涉及多个细胞株、过表达和(或)敲减细胞或不同处理条件下的荧光素酶报告实验、RT-qPCR、WB实验的多次实验和不同方法所得结果,工作量大大增加。 总之,发表SCI论文需要经过严格的审查和大量的实验验证,这使得整个过程显得格外漫长。
WB实验优化指南:提高效率与安全性 ### 凝胶制备的优化 ꊊ传统的WB实验中,凝胶制备是一个繁琐的过程。其实,你可以提前将去离子水、30% Acr-Bis、Tris、10% SDS、TEMED 等试剂混合在一起,保存在4Ⰳ避光的地方,有效期可达一个月或更长时间。这样,整个制胶过程就简化为了只需添加一种试剂。另外,为了方便上样,可以在上层胶中加入染料指示剂,形成预染胶。当然,你也可以选择使用商品化的制胶试剂盒,虽然价格稍高,但操作更简便。 电泳缓冲液制备的优化 电泳缓冲液的配方也有优化的空间。传统的配方在高电压下会出现蛋白质信号丢失的问题,而且不能明显缩短电泳时间。经过优化后的配方(Tris 38.1 mM、甘氨酸266.7 mM、HEPES 21.0 mM、SDS 3.5 mM、pH 8.3),可以在室温、200 V、35 min内完成电泳,并且高效分离小分子蛋白。300 V时仍能正常电泳,但电压过高容易产热,需要冰浴降温。建议配置5X的电泳液备用,因为1㗧冲液室温保存后容易发生絮凝。 转膜液制备的优化 在WB实验中,甲醇的毒性是一个大问题。其实,你可以用无水乙醇来替代甲醇配制转膜液。这样一来,所有需要用甲醇的地方都可以用乙醇替代(包括膜的活化和转膜液的配制)。为了自己的健康,做实验时,能用低毒或无毒的试剂替代时,一定要替代,不要因小失大! 转印膜选择的优化 转印膜的选择也会影响实验结果。0.45 NC 膜比 0.45 PVDF 膜更好地拦截蛋白质标记染料。对于小分子量蛋白,0.22 PVDF膜的截留能力明显强于0.45 PVDF膜和0.45 NC膜。一直以来,0.22 PVDF膜都是首选,因为它不会让小分子蛋白转过。 凝胶切割的优化 ✂️ WB条带是论文造假的重灾区。每年都有无数论文因蛋白质条带而在PubPeer上受到质疑。渐渐地,一些期刊开始提倡使用未切割的凝胶。未切割的凝胶虽然增加了工作量,但可以确认相应分子量的目标蛋白并验证一抗的特异性。另外,条带太宽也不是什么好事,这样会增加非特异性条带的产生。 通过这些优化方法,你可以提高WB实验的效率、安全性和准确性。希望这些建议对你的实验有所帮助!
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